CNAA   Consiliul Naţional
   pentru Acreditare şi Atestare
Versiune pentru tipar din cadrul site-ului www.cnaa.md
Originalul: /nomenclature/biology/030003/exam/

Programa examenului de doctorat

03.00.03 – Biologie moleculară

Recomandări metodice generale

Biologia moleculară se studiază cu scopul de a înţelege structura şi funcţia moleculelor de bază a celulei vii. În rezultatul studierii biologiei moleculare se obţin cunoştinţe ce ţin înţelegerea organizării moleculare a ADN-lui, ARN-lui, proteinelor. Structura şi funcţia genei, mecanismele de reglare a expresiei genice, organizarea moleculară a genomului, metodele de cercetare a genomului, rolul biologiei moleculare în medicină şi agricultură. Studiul profund al biologiei moleculare conduce spre obţinerea unor calităţi înalte profesionale de lucru cu moleculele celulei vii.

Conţinutul cursului

  1. Introducere (biologia moleculară, biologia, ştiinţă, obiectul biologiei)

    Obiectul Biologiei moleculare. Formarea Biologiei moleculare ca ştiinţă. Principalele descoperiri care au permis naşterea biologiei moleculare ca disciplină de sinestătătoare. Etapele de bază a dezvoltării biologiei moleculare. Aportul savanţilor din diferite ţări ce au adus la dezvoltarea accelerată a biologiei moleculare.

  2. Moleculele de bază a celulei vii (structura proteinelor, enzimele, centrifugare diferenciată, electroforeză, analiza Western).

    Proteinele, clasificarea lor. Principiile de bază a structurii proteinelor. Aminoacizii - elemente modulare a proteinelor. Varietatea aminoacizilor. Proprietăţile fizico-chimice a proteinelor. Arhitectura proteinelor. Nivelurile de structură a proteinelor şi caracterizarea lor. Modificările chimice a proteinelor şi activarea lor biologică (enzimele). Metodele de cercetare a proteinelor cromatografie, centrifucare diferenciată, electroforeză, metodele imunologice de identificare a proteinelor, analiza Western, rolul razelor Roentgen în cazul determinării nivelului de structură a proteinelor.

  3. Acizii nucleici. ADN, ARN. (ADN, ARN, acizi nucleici, bazele azotate, proprietăţi fizico-chimice, legături de tipul Watson-Crick, Hoogsteen, nucleozide, nucleotidele)

    Elementele de structură a acizilor nucleici. Bazele azotate, Structura lor chimică. Proprietăţile fizico-chimice a bazelor azotate. Interacţiunea între bazele azotate şi formarea legăturilor de hydrogen. Legăturile de tipul Watson-Crick, Hoogsteen. Interacţiunea de tipul “Stacking”. Nucleozidele şi nucleotidele. Proprietăţile lor fizico-chimice. Conformaţia nucleozidelor şi nucleotidelor în moleculele de ADN.

  4. ADN – material genetic universal. (temperatura de topire, denaturarea, renaturarea, cinetica de reasociere, purificarea ADNlui, ultracentrifugare, chromatografie, electroforeza, cartaj enzimatic).

    Descoperirea ADNului ca material genetic şi componenţa chimică a ADNului. Proprietăţile fizico-chimice a ADN-lui, temperatura de topire, denaturarea şi renaturarea, cinetica de reasociere a catenelor antipanalele a moleculei de ADN). Structura ADN-lui. Modelul Watson-Crick. Parametrii de structură a moleculei de ADN dublu catenar sub formă de spirală. Formele de ADN (forma A, B, C, Z). Diferenţa dintre ele conform parametrilor de structură. Metodele de cercetare a ADNlui. Izolarea şi purificarea ADNlui (principiile de bază). Ultracentrifugare, chromatografie, electroforeza, cartaj enzimatic, marcaj cu diferiţi izotopi radiocristalografie, determinarea structurii primare (metoda Maxam-Ghilbert şi Săngher).

  5. Replicarea moleculei de ADN. (replicare, aparat enzimatic, noţiune de replicon, catenă întîrziată de ADN, topografia replicării, replicon)

    Modelul semiconservativ de sinteză a ADNlui. Experienţele clasice a lui Meselson şi Stali, care au confirmat acest model. Caracteristica activităţii funcţionale ale secvenţelor de iniţiere a Replicării. Secvenţele ARS (Autonomously Replicating Sequences). Factorii de iniţiere şi caracteristica lor. Aparatul enzimatic al Replicării. Mecanismul molecular al replicării. Rolul segmentelor Okazaki în procesul de sinteză a catenei întârziate de ADN. Iniţierea sintezei fragmentelor Okazaki. Aparatul enzimatic ce contribuie la iniţierea sintezei fragmentelor Okazaki. Topografia replicării. Noţiune de replicon. Modelele de replicare şi caracterizarea lor.

  6. Repararea şi restricţia ADNlui. (sistem de restricţie a ADNlui , metilarea ADNlui endogen, ezimele de restricţie, repararea ADNlui, aparat enzimatic, eucariote).

    Caracterizarea sistemului de restricţie şi metilare a ADNlui. Metilarea ADNlui endogen şi rolul metilării în protecţia ADNlui. Mecanismul metilării. Enzimele de restricţie. Rolul lor în menţinerea structurii şi funcţiei ADNlui endogen. (Exemple la bacterii şi fagi). Interacţiunea şi mecanismul coordinativ de activare a genelor ce codifică enzimele de restricţie şi metilare. Repararea ADNlui. Mecanismul de reparare prin intermediul procesului de excizie. Aparatul enzimatic ce contribuie la repararea ADNlui. Repararea la eucariote. Caracteristica genelor de reparare, la eucariote, familia de gene RAD. Expresia diferenţiată a genelor RAD.

  7. Recombinarea ADNlui. (recombinare, segmente omoloage, recombinarea site-specifică, enzime de bază).

    Recombinarea între segmente omoloage de ADN. Recombinarea site-specifică. Modelul clasic ce reflectă recombinarea între 2 molecule de ADN. Modelul Holliday. Mecanismul de recombinare. Enzimele de bază ce se implică în procesul de recombinare.

  8. Transcrierea ADNlui (transcripţie, secvenţe specifice de ADN, promotor, elongare, polimeraza, terminator).

    Noţiune de transcripţie. Iniţierea transcripţiei. Enzimele principale ce contribuie la iniţierea transcripţiei. Secvenţe specifice de ADN, ce sunt recunoscute de ARN-polimerază. Noţiune de promotor. Rolul promotorului în transcripţie, domeniile conservate şi rolul lor în activitatea promotorului. Descoperirea promotorului şi identificarea acestuia la genele organismelor eucariote. Elongarea transcripţiei. Interacţiunea dintre secvenţe de ADN (ce se transcriu) şi ARN – polimerază. Terminarea transcripţiei. Noţiune de terminator. Rolul terminatorului în terminarea transcripţiei. Aparatul metodologic de cercetare a transcripţiei.

  9. Reglarea transcripţiei. (procariote, operon, gene de structură, gene de reglare, mecanism de reglare, clustere, eucariote, secvenţe de reglare a transcripţiei, ARN-polimeraze, secvenţe regulatoare “Cis” “Trans ”, elemente migratoare, insulatori silencieri).

    Mecanismele de reglare a) procariote. Noţiune de operon, gene de structură, gene de reglare. Mecanismul de reglare a transcripţiei a operonului lac.Z. Reglarea transcripţiei a genelor de structură sub formă de clastere. Mecanizmul şi specificitatea interacţiunei ADN – proteina în reglarea transcripţiei. b) Eucariote. Principiile generale de transcripţie la eucariote organizarea moleculară şi locul secvenţelor de reglare a transcripţiei la eucariote. Tipurile de ARN-polimeraze necesare pentru transcrierea la eucariote. Secvenţele regulatoare “Cis” “Trans ”. Rolul lor în procesul de accelerare a transcripţiei. Mecanismele de reglare a transcripţiei la eucariote.

    1. Rolul factorilor de transcripţie.
    2. Identificarea domeniilor funcţionale a factorilor de transcripţie. Rolul lor în procesul de interacţiune ADN – proteină. Rolul moleculelor de ADN nuclear mici “small nuclear RNA” în procesul de reglare a transcripţiei.
    3. Rolul elementelor migratoare în procesul de reglare a transcripţiei. Clasificarea factorilor de transcripţie - baza reglării expresiei. Noţiune de insulatori silencieri şi rolul lor în reglarea transcripţiei.

  10. Maturizarea ARN - lui mesager. (procesing, splising, procesul de polyade, segmente poly (A) a ARNm, proteine, complexul de ribonucleoproteine, informosome, intron şi exon).

    Noţiune de procesing şi splising. Etapele de maturizare a ARNlui. Procesul de poliadenilare. Rolul segmentelor poli (A) a ARNm. Interacţiunea ARNm – proteine. Rolul proteinelor în complexul de ribonucleoproteine. Noţiune de informosome. Proprietăţile fizico-chimice a informosomelor. Rolul lor în celulă. Mecanismul splisingului. Etapele enzimatice a splicingului. Noţiune de intron şi exon. Situsurile de nucleotide conservate la hotarele intron-exon. Rolul lor în realizarea splisingului. Realizarea splising-ului alternativ, autosplisingul. Formarea capătului 5/ la ARNm. Noţiune de căp. Rolul lui în iniţierea translării ARNm. Metodele de cercetare a ARNm pre-ARNm şi a splising-ului. Metodele de identificare а intronilor şi exonilor.

  11. Organizarea moleculară а genomului. (secvenţe repetitive, moderate, înalt repetitive şi unicale, secvenţe polindromice, ADNul satelitic (Satelit), cinetica de reasociere а ADN-lui, gene unicale, pseudogene, ADN-ul egoist, ADN-ul mitocondrial, codul genetic а mitocondriilor, sinteza proteinelor mitocondriale, ADN plastidic).

    Secvenţe repetitive, moderate, înalt repetitive şi unicale. Secvenţe polindromice. Rolul lor în genom . ADNul satelitic (Satelit) Identificarea ADNlui satelitic. Varietăţile de ADN satelitic în genomul diferitor specii (conform organizării moleculare şi proprietăţilor fizico-chimice. Diferenţa între aceste secvenţe conform procentajului de prezenţă în genom. Metodele clasice şi contemporane de determinare а acestor secvenţe în genom. Cinetica de reasociere а ADN-lui. Determinarea dimensiunii genomurilor. Gene unicale, gene sub formă de clastere şi familii de gene. Noţiune de pseudogene. Secvenţe de ADN parazitare. ADN-ul egoist. Analiza moleculară а genomului. Genomul organelelor ADN-ul mitocondrial structura şi organizarea lui moleculară. Dimensiunea ADN mitocondrial. Asemănarea şi diferenţierea ADN-lui mitocondrial la animale şi plante. Codul genetic а mitocondriilor şi specificitatea lui. Sinteza proteinelor mitocondriale şi importanţa lor. Interacţiunea între genomul nuclear şi genomul mitocondrial. ADN-lui plastidic. Structura şi organizarea moleculară а ADN-lui plastidic. Expresia şi reglarea expresiei genelor а genomului plastidic. Interacţiunea între genomul nuclear şi genomul plastidic.

  12. Elementele migratoare în genom şi organizarea lor moleculară, clasificarea lor. (procariote, eucariote, elemente migratoare, IS secvenţe, transpozonii – Tn, drojdii, drozofilă, plante, animale, om, fenomen de disgeneză hibridă la drozofilă).

    a) procariote; b) eucariote. Organizarea moleculară a elementelor migratoare la procariote. IS secvenţe, clasificarea lor. Mecanismul de transpoziţie pe genom. Transpozonii- Tn Clasificarea şi organizarea lor moleculară. Mecanizmul de transpoziţie b) Organizarea moleculară şi clasificarea lor la drojdii, drozofilă, plante, animale şi om. Rolul elementelor migratoare în fenomenul de disgeneză hibridă la drozofilă. Mecanismul de transpoziţie a elementelor migratoare în genomul de drozofilă. Elementele migratoare autonome şi neautonome la porumb. Mecanismul lor de transpoziţie. Influenţa elementelor migratoare la expresia genelor.

  13. Retroviruşii şi Retrotranspozonii. (retroviruşilor, transpoziţie, retrotranspozoni).

    Organizarea moleculară a retroviruşilor Mecanizmul de integrare a retroviruşilor în genomul străin. Transpoziţia lor în genomul străin. Retrotranspozonii la eucariote. Organizarea moleculară a retrotranspozonilor şi clasificarea lor. Mecanismul lor de transpoziţie. Rolul lor în genom.

  14. Biotehnologia ADNlui Recombinant. (noţiune de vector, plazmidele, fagii şi cosmidele, clonarea segmentelor de ADN, molecule recombinante, biblioteci genomice, cromosomă artificială, etape enzimatice, celula bacteriana, oligonucleotidele, organizme transgenice, sistem heterogen).

    Noţiune de vector. Plazmidele, fagii şi cosmidele. Varietatea lor. Utilizarea lor în clonarea segmentelor de ADN. Capacitatea vectorilor şi importanţa lor pentru clonare. Obţinerea moleculelor Recombinant de ADN. Metodele de cercetare a moleculelor recombinante de ADN. Construirea unei biblioteci genomice. Noţiune de bibliotecă genomică. Rolul enzimelor de restricţie în obţinerea şi analiza moleculelor recombinante de ADN.. Identificarea şi izolarea genelor din biblioteca genomică. Obţinerea, izolarea şi clonarea segmentelor de ADN ce dispun de mari (de la 100-3100 kb). Utilizarea vectorilor YAC (cromosomă artificială de la drojdii) şi BAC (cromosoma artificială de la bacterii) în clonarea segmentelor de ADN de talii mari. Construirea unei biblioteci de ADNc, începînd cu un set de mesageri. Etapele enzimatice necesare pentru obţinerea băncii de ADNc. Metodele de bază pentru identificarea şi izolarea unui clon de ADNc individual. Expresia unui clon de ADNc în celula bacteriana. Metodele de cercetare a expresiei la nivel de transcripţie şi la nivel de translare. Sinteza segmentelor de ADN şi oligonucleotidelor pe cale chimică şi principiile ei de bază. Rolul oligonucleotidelor sintetizate pe cale chimică în cercetarea moleculelor recombinante de ADN şi a genomului. Transferul de gene străine în genom. Principalele procedee de transfer la eucariote (drojdii, animale şi plante). Varietatea vectorilor cu ajutorul cărora se efectuează transferul de gene. Integrarea moleculei de ADN străin în genomul recipient. Mecanizmul de integrare a ADN-lui străin în genomul recipient. Analiza ADN-lui străin integrat în genomul organizmelor transgenice. Expresia genelor străine. Metodele de cercetare a expresiei genelor străine integrate în genomul organizmelor transgenice. Organizmele transgenice - ca un instrument de cercetare a expresiei genelor într-un sistem heterogen. Importanţa şi aplicarea organismelor transgenice în practică.

  15. Anatomia moleculară a cromosomului. (nucleoidul, viruşuri, virion, ribonucleoproteine, matrix nuclear, nucleosomă, mono, di, tri, tetra-nucleosomelor, cromatinei).

    Organizarea moleculară şi nivelul de structură a nucleoidului la bacterii. Genomul viruşurilor şi nivelul de condensare. Noţiune de virion. Structura particulelor RNP (ribonucleoproteine) la virion. Organizarea moleculară a cromatinei. Matrixul nuclear. Noţiune de nucleosomă. Caracterizarea nucleosomei ca unitate de structură a cromatinei. Separarea şi analiza moleculară a mono, di, tri, tetra-nucleosomelor. Rolul nucleosomelor în menţinerea structurii de cromatina. Caracterizarea şi proprietăţile fizico-chimice a octamerului de histone. Rearangeamentul histonelor în nucleosome şi importanţa lui în menţinerea stabilă a structurii nucleosomei. Modele de organizare structurală a nucleosomei. Rolul şi importanţa nucleosomei în transcripţie. Caracterizarea şi analiza regiunelor (situsilor) hypersensibile ale cromatinei către ADN-ase. Domene specifice ale cromatinei care conţin gene active. Analiza moleculară a acestor domene. Metodele de cercetare a cromatinei.

  16. Sinteza proteinelor. (ribozomă, proteine, situsiri de acceptare, peptidyl-ARNt (donor site), complex de iniţeire, ARNm – 305 (IF3), elongare, ARN-l de transport, aminoacelarea ARNt, codon-anticodon, transpipdedarea şi translocarea, ARN-l ribozomal, sistem acelular).

    Organizarea de structură a ribozomei. Etapele de sinteză a proteinelor şi caracterizarea lor. Iniţierea sintezei proteinelor. Caracterizarea situsirilor de acceptare (acceptor site) A şi situsului pentru peptidyl-ARNt (donor site) P. Rolul subunităţii mici 30S (sau 40S la eucariote) în procesul de iniţiere. Caracterizarea şi proprietăţile fizico-chimice a factorilor de iniţiere a sintezei proteinei IF (IF1, IF2, IF3) la procariote şi cIF (cIF1, eIF2, eIF3, eIF4, eIF5 şi eIF6) la eucariote. Rolul şi caracterizarea ARNt specific (N-formyl-methionyl-tRNA) în procesul de iniţiere a sintezei proteinei. Formarea complexului de iniţiere şi caracterizarea lui. Recunoaşterea complexului de iniţeire de către ARNm. Legarea complexului de iniţiere (ARNm – 305 (IF3) cu subunitatea mare 30S. Elongarea. Mecanismul de elongare. Caracteristica şi proprietăţile fizico-chimice a factorilor de elongare (EF-iu). Formarea complexului binar EF-Tu.GTP. Rolul acestui complex în etapa elongării a procesului de sinteză a proteinelor. Factorii de elongare la eucariote EF-Tu, EF-Ts şi varietăţile lor. ARN-ul de transport şi rolul lui în sinteza proteinei. Structura şi conformaţia ARN-lui de transport. Modificarea structurală a ARN-lui de transport. Aminoacelarea ARNt. Importanţa acestui proces. Mecanismul de aminoacelare a ARN-lui de transport. Caracteristica interacţiunii specifice codon-anticodon. Codul genetic şi însemnătatea lui. Familiile de codoane şi specificul lor. Transpipdedarea şi translocarea - formarea legăturii peptidice între aminoacizi. Terminarea translării a ARNm (terminarea procesului de sinteză a proteinei). Caracteristica codoanelor de terminare. Factorii de terminare a translării RF (RF1, RF2, RF3). Rolul ARN-lui ribozomal în procesul de sinteză a proteinei. Sinteza proteinei într-un sistem acelular. Caracteristica şi importanţa acestui sistem. Metodele de cercetare a procesului de sinteză a proteinelor.

  17. Rolul biologiei moleculare în cercetările medicale şi agricole. (proces de cancerogeneză, oncogene, factori de transcripţie, sistem imun, gene de immunoglobuline, markeri moleculari, hibridomă, maladii ereditare, markeri moleculari (primeri) specifici, clonare, ameliorare, analiza RFLP, strategii experimentale, RAPD, SCAR, AFLP, DAF, SPN).

    Biologia moleculară şi procesul de cancerogeneză. Descoperirea oncogenelor. Clasificarea şi originea lor. Organizarea moleculară a oncogenelor. Expresia oncogenelor şi factorii de transcripţie, ce reglează expresia lor. Factorii de transcripţie şi rolul lor. Aspecte moleculare al sistemului imun. Descoperirea genelor de immunoglobuline. Diversitatea immunoglobulinelor şi rearangeamentul segmentelor de ADN ce conţin gene de immunoglobuline. Mecanizmul de reglare a expresiei genelor de immunoglobuline. Testarea sistemului immun cu ajutorul markerilor moleculari. Noţiune de hibridomă. Rolul hibridomei în cercetările moleculare şi aplicative. Biologia moleculară şi bolile ereditare. Analiza moleculară a genomului la populaţii de oameni la care s-au depistat maladii ereditare. Varietatea de markeri moleculari (primeri) specifici, necesari pentru depistarea rapidă a maladiilor ereditare. Cercetările moleculare a genomului la plante, clonarea şi identificarea markerilor moleculari ce permit aprecierea însuşirilor preţioase a genotipurilor de plante utilizate în ameliorare. Caracterizarea şi importanţa analizei RFLP şi a diferitelor strategii experimentale bazate pe reacţia de PCR: RAPD, SCAR, AFLP, DAF, SPN şi altele a genomului la plantele de cultură. Realizările promiţătoare a biologiei moleculare în medicină şi agricultură.

Literatura de specialitate:

  1. Уотсон Молекулярная биология гена, 1982, Из-во “Мир”, Москва.
  2. Стент Молекулярная генетика, 1984, Из-во «Мир» Москва.
  3. Льюн. Гены, 1987, Изд-во Мир, Москва.
  4. Зенбуш. Молекулярная и клеточная биология, 1982 , 3х Томах.
  5. Айала Ф Кайгер Д. Современная генетика – в 3х Томах, 1987, Из-во «Мир», Москва.
  6. M.Singer and P.Berg, Genes and genomes, 1991, University Science Books
  7. L.Baltimore, B. Zipunnsky and M. Darnell. Molecular cell Biology III edition 1995, New York and Oxford.
  8. B. Lewin, Genes, 1997, IV edition Oxford University Press.
  9. Lewin B. Genes. 2001 VII edition, Oxford University Press.

Bibliografia suplimentară:

  1. J.Sambrook, E.F. Fritsch, T.Maniatis Molecular Cloning, 1989, ed. II Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  2. Клонирование ДНК, Гловер 1988 Из-во «Мир»
  3. Транскрипция и трансляция. Методы 1990 Из-во «Мир».



Copyright © 2001–2010 Consiliul Naţional pentru Acreditare şi Atestare