Исследование полиморфизма генов F8 и F9 у пациентов с гемофилией А и В в Республике Молдова
|
СтатусДиссертация была зашищена 20 мая 2010Утверждена Национальным Советом 5 июля 2010 Автореферат – 1.84 Mb / на румынском – 1.90 Mb / на русском |
Ключевые слова
гемофилия, гены F8 и F9, факторы VIII и IX, генотип, мутации, полиморфные локусы, молекулярная диагностикаАннотация
Диссертация содержит: Введение, 4 главы, выводы и практические рекомендации, библиографию из 159 источников, 5 приложений, 96 страниц основного текста, 12 таблиц, 29 рисунков. Полученные результаты опубликованы в 11 научных работах.
Ключевые слова: гемофилия, гены F8 и F9, факторы VIII и IX, генотип, мутации, полиморфные локусы, молекулярная диагностика.
Область исследований: 03.00.15 – генетика
Цель работы: проведение молекулярно-генетического анализа генов F8 и F9 в семьях с гемофилией А и В.
Задачи: создание банка ДНК семей с гемофилией А и В, исследование кодирующей области и областей экзон-интронных соединений генов факторов VIII и IX у пациентов с гемофилией А и В, изучение полиморфизмов данных генов и определение аллельной ассоциации между полиморфизмами, разработка эффективной схемы молекулярной диагностики для профилактики гемофилии А и В в Республике Молдова.
Научная новизна. Впервые для пациентов с гемофилией А и В в Республике Молдова получены данные о спектре и частоте мутаций в генах F8 и F9, обнаружено 17 ранее не описанных мутаций. Получены данные по распределению аллелей полиморфных локусов и определена степень аллельных ассоциаций между полиморфизмами внутри генов.
Теоретическая значимость. Полученные результаты расширяют представления о молекулярной природе гемофилии и функциональных последствиях мутаций в генах факторов свертывания.
Практическая значимость. Создан банк ДНК больных и членов семей с гемофилией А и В (198 образцов). Выявлены мутации генов F8 и F9 в РМ. Разработана диагностическая схема, позволяющая идентифицировать до 85,7% мутаций в гене F8 и до 100 % в гене F9 у больных с диагнозом гемофилия А или В. Полученные данные применены для выявления больных группы риска развития аллоиммутнных ингибиторов при гемофилии А, определения носительниц заболевания и пренатальной диагносики.
Полученные научные результаты внедрены в практику генетического консультирования гемофилии в Национальном Центре Репродуктивного Здоровья и Медицинской Генетики.
Содержание
- 1.1 История изучения гемофилии
- 1.2 Биохимические основы процесса свертывания крови
- 1.2.1 Роль фактора VIII и фактора IX в процессе коагуляции крови
- 1.2.2 Структура фактора VIII и функциональная характеристика его субъединиц
- 1.2.3 Структура и функция фактора IX
- 1.3 Молекулярные основы гемофилии А
- 1.3.1 Ген фактора VIII
- 1.3.2 Мутации гена F8
- 1.3.3 Полиморфизмы гена фактора VIII
- 1.3.4 Экспрессия гена F8
- 1.4 Молекулярные основы гемофилии В
- 1.4.1 Ген фактора IX
- 1.4.2 Мутации гена F9
- 1.4.3 Полиморфизмы гена фактора IX
- 1.5 Клиническая характеристика гемофилии А и В
- 1.6 Медико-генетическое консультирование
- 1.6.1 Молекулярная диагностика
- 1.6.2 Пренатальная диагностика
- 1.7 Выводы главы 1
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- 2.1 Материалы
- 2.1.1 Характеристика семей с гемофилией А и В
- 2.1.2 Создание регистра и банка ДНК семей с гемофилией А и В
- 2.1.3 Оборудование
- 2.1.4 Реактивы и ферменты
- 2.1.5 Буферные и концентрированные растворы
- 2.2 Методы
- 2.2.1 Выделение геномной ДНК
- 2.2.1.1 Выделение ДНК из цельной крови
- 2.2.1.2 Выделение ДНК из ворсин хориона
- 2.2.1.3 Выделение ДНК из амниотической жидкости
- 2.2.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- 2.2.2.1 Стандартная ПЦР-амплификация
- 2.2.2.2 ПЦР длинных фрагментов
- 2.2.3 Реакция рестрикции
- 2.2.4 Гетеродуплексный анализ
- 2.2.5 Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера
- 2.2.5.1 Очистка ПЦР продуктов
- 2.2.5.2 Приготовление ПЦР для автоматического секвенирования
- 2.2.5.3 Концентрирование продукта ПЦР для автоматического секвенирования
- 2.2.6 Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
- 2.2.7 Разделение фрагментов ДНК электрофорезом в полиакриламидном геле
- 2.2.8 Биоинформатическая обработка
- 2.2.10 Статистический анализ данных
- 3.1 Молекулярный анализ мутаций гена F8 у больных с гемофилией А
- 3.1.1 Исследование инверсий интрона 22 и интрона 1
- 3.1.2 Генетический анализ неинверсионных мутаций
- 3.1.2.1 Мутации сайтов сплайсинга
- 3.1.2.2 Мутации со сдвигом рамки считывания
- 3.1.2.3 Нонсенс-мутации
- 3.1.2.4 Миссенс-мутации
- 3.1.3 Частота мутаций при гемофилии А и их распределение в гене F8
- 3.2 Исследование полиморфизмов гена F8 в выборке здорового населения РМ
- 3.2.1 Исследование HindIII полимофизма в интроне 19
- 3.2.2 Исследование Alu I полиморфизма в интроне 1
- 3.2.3 Исследование G/A полиморфизма в интроне 7 (AlwNI полиморфизм)
- 3.2.4 Исследование микросателлитных (СА)n повторов в интроне 13
- 3.3. Практическое применение ДНК-анализа в семьях с гемофилией А
- 3.4 Выводы главы 3
- 4.1 Молекулярно-генетическое исследование гена F9 у пациентов с гемофилией В
- 4.2 Полиморфизмы гена F9 в выборке здорового населения РМ
- 4.2.1 Анализ распределения аллелей VNTR-подобного локуса DdeI в интроне 1
- 4.2.2 Исследование MseI полиморфизма
- 4.2.3 Исследование полиморфизма HhaI
- 4.2.4 Исследование полиморфизма MnlI в экзоне 6
- 4.2.5 Исследование полиморфизма TaqI в интроне 4
- 4.2.6 Исследование аллельных ассоциаций в гене F9
- 4.3 Практическое применение ДНК-анализа в семьях с гемофилией В
- 4.4 Выводы главы 4
Официальные оппоненты
- Maria Duca
доктор хабилитат, профессор, Государственный Университет Молдовы - Igor Cemortan
доктор, доцент, Государственный университет медицины и фармации им. Николая Тестемицану
Члены Ученого Совета
- Galina Lupaşcu, председатель
доктор хабилитат, профессор, Институт генетики, физиологии и защиты растений АНМ - Eugenia Cotenco, секретарь
доктор, доцент - Nicolae Bucătaru, член
доктор хабилитат, профессор - Ghenadie Curocichin, член
доктор хабилитат, профессор, Государственный университет медицины и фармации им. Николая Тестемицану - Lidia Tumanov, член
доктор, доцент
Диссертации
