Аттестационная комиссия
Комиссия по аккредитации
Комиссия по экспертов
Распоряжения, инструкции
Нормативные акты
Номенклатура
Организации
Ученые советы
Семинары
Диссертации
Научные руководители
Ученые
Докторанты
Постдокторанты
CNAA logo

 română | русский | english


Исследование полиморфизма генов F8 и F9 у пациентов с гемофилией А и В в Республике Молдова


Автор: Sirocova Natalia
Степень:доктор биологических наук
Специальность: 03.00.15 - Генетика
Год:2010
Научный руководитель: Nicolae Barbacar
доктор хабилитат, профессор, Институт генетики, физиологии и защиты растений АНМ
Институт: Институт генетики, физиологии и защиты растений АНМ
Ученый совет: DH 10-03.00.15-27.03.08
Институт генетики, физиологии и защиты растений АНМ

Статус

Диссертация была зашищена 20 мая 2010
Утверждена Национальным Советом 5 июля 2010

Автореферат

Adobe PDF document1.90 Mb / на русском
Adobe PDF document1.84 Mb / на румынском

Ключевые слова

гемофилия, гены F8 и F9, факторы VIII и IX, генотип, мутации, полиморфные локусы, молекулярная диагностика

Аннотация

Диссертация содержит: Введение, 4 главы, выводы и практические рекомендации, библиографию из 159 источников, 5 приложений, 96 страниц основного текста, 12 таблиц, 29 рисунков. Полученные результаты опубликованы в 11 научных работах. Ключевые слова: гемофилия, гены F8 и F9, факторы VIII и IX, генотип, мутации, полиморфные локусы, молекулярная диагностика. Область исследований: 03.00.15 – генетика Цель работы: проведение молекулярно-генетического анализа генов F8 и F9 в семьях с гемофилией А и В. Задачи: создание банка ДНК семей с гемофилией А и В, исследование кодирующей области и областей экзон-интронных соединений генов факторов VIII и IX у пациентов с гемофилией А и В, изучение полиморфизмов данных генов и определение аллельной ассоциации между полиморфизмами, разработка эффективной схемы молекулярной диагностики для профилактики гемофилии А и В в Республике Молдова. Научная новизна. Впервые для пациентов с гемофилией А и В в Республике Молдова получены данные о спектре и частоте мутаций в генах F8 и F9, обнаружено 17 ранее не описанных мутаций. Получены данные по распределению аллелей полиморфных локусов и определена степень аллельных ассоциаций между полиморфизмами внутри генов. Теоретическая значимость. Полученные результаты расширяют представления о молекулярной природе гемофилии и функциональных последствиях мутаций в генах факторов свертывания. Практическая значимость. Создан банк ДНК больных и членов семей с гемофилией А и В (198 образцов). Выявлены мутации генов F8 и F9 в РМ. Разработана диагностическая схема, позволяющая идентифицировать до 85,7% мутаций в гене F8 и до 100 % в гене F9 у больных с диагнозом гемофилия А или В. Полученные данные применены для выявления больных группы риска развития аллоиммутнных ингибиторов при гемофилии А, определения носительниц заболевания и пренатальной диагносики. Полученные научные результаты внедрены в практику генетического консультирования гемофилии в Национальном Центре Репродуктивного Здоровья и Медицинской Генетики.

Содержание


1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА ГЕМОФИЛИИ
  • 1.1 История изучения гемофилии
  • 1.2 Биохимические основы процесса свертывания крови
  • 1.2.1 Роль фактора VIII и фактора IX в процессе коагуляции крови
  • 1.2.2 Структура фактора VIII и функциональная характеристика его субъединиц
  • 1.2.3 Структура и функция фактора IX
  • 1.3 Молекулярные основы гемофилии А
  • 1.3.1 Ген фактора VIII
  • 1.3.2 Мутации гена F8
  • 1.3.3 Полиморфизмы гена фактора VIII
  • 1.3.4 Экспрессия гена F8
  • 1.4 Молекулярные основы гемофилии В
  • 1.4.1 Ген фактора IX
  • 1.4.2 Мутации гена F9
  • 1.4.3 Полиморфизмы гена фактора IX
  • 1.5 Клиническая характеристика гемофилии А и В
  • 1.6 Медико-генетическое консультирование
  • 1.6.1 Молекулярная диагностика
  • 1.6.2 Пренатальная диагностика
  • 1.7 Выводы главы 1

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 2.1 Материалы
    • 2.1.1 Характеристика семей с гемофилией А и В
    • 2.1.2 Создание регистра и банка ДНК семей с гемофилией А и В
    • 2.1.3 Оборудование
    • 2.1.4 Реактивы и ферменты
    • 2.1.5 Буферные и концентрированные растворы

  • 2.2 Методы
    • 2.2.1 Выделение геномной ДНК
    • 2.2.1.1 Выделение ДНК из цельной крови
    • 2.2.1.2 Выделение ДНК из ворсин хориона
    • 2.2.1.3 Выделение ДНК из амниотической жидкости
  • 2.2.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
    • 2.2.2.1 Стандартная ПЦР-амплификация
    • 2.2.2.2 ПЦР длинных фрагментов
  • 2.2.3 Реакция рестрикции
  • 2.2.4 Гетеродуплексный анализ
  • 2.2.5 Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера
    • 2.2.5.1 Очистка ПЦР продуктов
    • 2.2.5.2 Приготовление ПЦР для автоматического секвенирования
    • 2.2.5.3 Концентрирование продукта ПЦР для автоматического секвенирования
  • 2.2.6 Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
  • 2.2.7 Разделение фрагментов ДНК электрофорезом в полиакриламидном геле
  • 2.2.8 Биоинформатическая обработка
  • 2.2.10 Статистический анализ данных
3. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА F8 В СЕМЬЯХ С ГЕМОФИЛИЕЙ А И В ВЫБОРКЕ ЗДОРОВОГО НАСЕЛЕНИЯ
  • 3.1 Молекулярный анализ мутаций гена F8 у больных с гемофилией А
    • 3.1.1 Исследование инверсий интрона 22 и интрона 1
    • 3.1.2 Генетический анализ неинверсионных мутаций
    • 3.1.2.1 Мутации сайтов сплайсинга
    • 3.1.2.2 Мутации со сдвигом рамки считывания
    • 3.1.2.3 Нонсенс-мутации
    • 3.1.2.4 Миссенс-мутации
    • 3.1.3 Частота мутаций при гемофилии А и их распределение в гене F8
  • 3.2 Исследование полиморфизмов гена F8 в выборке здорового населения РМ
    • 3.2.1 Исследование HindIII полимофизма в интроне 19
    • 3.2.2 Исследование Alu I полиморфизма в интроне 1
    • 3.2.3 Исследование G/A полиморфизма в интроне 7 (AlwNI полиморфизм)
    • 3.2.4 Исследование микросателлитных (СА)n повторов в интроне 13
  • 3.3. Практическое применение ДНК-анализа в семьях с гемофилией А
  • 3.4 Выводы главы 3
4. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА F9 У БОЛЬНЫХ С ГЕМОФИЛИЕЙ B И В ВЫБОРКЕ ЗДОРОВОГО НАСЕЛЕНИЯ
  • 4.1 Молекулярно-генетическое исследование гена F9 у пациентов с гемофилией В
  • 4.2 Полиморфизмы гена F9 в выборке здорового населения РМ
    • 4.2.1 Анализ распределения аллелей VNTR-подобного локуса DdeI в интроне 1
    • 4.2.2 Исследование MseI полиморфизма
    • 4.2.3 Исследование полиморфизма HhaI
    • 4.2.4 Исследование полиморфизма MnlI в экзоне 6
    • 4.2.5 Исследование полиморфизма TaqI в интроне 4
    • 4.2.6 Исследование аллельных ассоциаций в гене F9
  • 4.3 Практическое применение ДНК-анализа в семьях с гемофилией В
  • 4.4 Выводы главы 4