Elaborarea mediilor de cultură pentru diagnosticul de laborator al infecţiei cu Campylobacter
|
StatutTeza a fost susţinută pe 22 aprilie 2005 în CSSşi aprobată de CNAA pe 23 iunie 2005 Autoreferat – 0.38 Mb / în română |
Cuvinte Cheie
campilobacterii termofile, izolare, cultivare, identificare, medii de culturăAdnotare
Lucrarea este dedicată perfectării diagnosticului de laborator al bolii diareice acute, cauzate de campilobacterii termofile. Constituie un studiu experimental în domeniul cultivării şi identificării microorganismelor Campylobacter cu investigaţii diagnostice de cercetare, realizate pe un lot de pacienţi cu sindrom diareic acut.
În baza premizelor teoretice (predominarea ciclului glutamic în metabolismul campilobacteriilor şi a dependenţii activităţii lui de prezenţa ionilor de potasiu) şi a investigărilor experimentale (alternarea diferitor nutrienţi), au fost elaborate două medii de cultură noi pentru cultivarea campilobacteriilor termofile.
Primul - mediul de cultură pentru izolarea şi diferenţierea campilobacteriilor termofile (cu sânge) este destinat izolării şi diferenţierii concomitente a campilobacteriilor termofile. El constă din digerat de cazeină, peptonă fermentativă, extract de drojdii, agar, clorură de potasiu, sânge de la donator şi supliment selectiv de antibiotice (cefazolină, rifampicină, polimixină M sulfat, nizoral). Mediul asigură creşterea Campylobacter peste 48 de ore de incubare în condiţii de microaerofile şi hipercapnie la +420C. Se asigura formarea a doua tipuri de colonii specifice pentru C.jejuni şi pentru C.coli, în baza morfologiei cărora este posibilă diferenţierea lor la etapa izolării. În consecinţă, răspunsul investigării bacteriologice poate fi eliberat cu o zi mai devreme comparativ cu termenul prevăzut în schema actuală de investigaţii. Suplimentar decade necesitatea realizării testelor enzimatice de diferenţiere, metoda fiind mult mai economă.
Al doilea - mediul de cultură pentru izolarea şi cultivarea campilobacteriilor termofile cu acid L-glutamic (transparent, fără sânge) este destinat izolării şi cultivării a C.jejuni şi C.coli. Mediul include aceiaşi bază nutritivă, iar sângele e substituit cu acid Lglutamic şi săruri care diminuează potenţialul oxido-reducător al mediului (metabisulfit de sodiu şi sulfat fier). Mediul asigură creşterea tulpinilor repicabile de C.jejuni şi C.coli cu caractere morfologice tipice peste 48 de ore incubare la +420C în condiţii microaerofile şi creşterea diferenţiată a C.jejuni şi C.coli.
În procesul elaborării şi cercetării mediilor de cultură noi au fost investigaţi 182 de copii cu sindrom diareic acut în vârsta de până la 3 ani. Rezultatele obţinute au confirmat ponderea înaltă în etiologia BDA la copiii de vârstă fragedă a campilobacteriilor termofile (18,1%) faţă de salmonele (13,7%) şi shigele (1,6%). Au fost studiate caracterele de cultură şi biochimice ale tulpinilor izolate, efectuată identificarea lor la nivel de gen, diferenţierea la nivel de specie şi subspecie. Dintre tulpinile izolate 43,8% au fost referite la specia C.jejuni (biovarul 1 - 64,3% şi biovarul 2 - 35,7%); 56,2% tulpini - la specia C.coli (biovarul 1 - 72,2% şi biovarul 2 – 27,8%). Veridicitatea identificării C.jejuni şi C.coli în baza morfologiei coloniilor a fost confirmată integru prin teste biochimice şi investigaţii genetice (PCR).
A fost studiată sensibilitatea tulpinilor de campilobacterii termofile izolate de la bolnavi faţă de medicamentele antibacteriene. A fost constatată sensibilitatea lor universală la eritromicină, cloramfenicol, gentamicină şi furagină. Toate tulpinile au fost rezistente la cefalosporinele de generaţia 1. Circulaţia tulpinilor rezistente la polimixină B a constituit 31,3%, la ampicilină – 18,8%, la ciprofloxacină – 15,6%, la acidul nalidixic - 9,4%. Rezistente faţă de 2 antibiotice au fost determinate 40,6% tulpini, la 3 şi 4 antibiotice au fost 9,4% şi 6,3% tulpini respectiv.
Au fost studiate condiţiile de păstrare a tulpinilor de C.jejuni şi C.coli pe mediul “MTC–
Campylobacter”, experimental fiind confirmată schema păstrării îndelungate a
campilobacteriilor pe acest mediu de cultură în condiţiile unui laborator practic.
Cuprins
- 1.1 Istoric
- 1.2 Taxonomia şi clasificarea campilobacteriilor
- 1.3 Importanţa epidemiologică şi clinică a campilobacteriilor grupului „termofile”
- 1.4 Metodele de bază în diagnosticul de laborator al campilobacteriozelor
- 1.4.1 Metoda microscopică
- 1.4.2 Metoda bacteriologică
- 1.4.2.1 Temperatura de cultivare
- 1.4.2.2 Atmosfera de cultivare
- 1.4.2.3 Mediile de cultură
- 1.4.2.4 Metode de obţinere a culturilor pure de campilobacterii termofile
- 1.5 Metode de identificare a campilobacteriilor
- 1.5.1 Metoda fenotipică
- 1.5.2 Determinarea conţinutului acizilor graşi ai celulei microbiene
- 1.5.3 Determinarea profilului proteic al celulei microbiene
- 1.5.4 Identificarea campilobacteriilor termofile prin metode ale biologiei moleculare
- 1.6 Identificarea infraspecifică a campilobacteriilor (tipizarea)
- 1.7 Testarea campilobacteriilor termofile la rezistenţă faţă de antibiotice
- 1.8 Păstrarea culturilor
- 1.9 Diagnosticul imunologic al campilobacteriozelor
- 1.10 Diagnosticul campilobacteriozelor prin metode ale biologiei moleculare
CAPITOLUL 2. Materiale şi metode de investigaţie
CAPITOLUL 3. Elaborarea mediilor de cultură pentru microorganismele din genul Campylobacter
- 3.1 Mediul de cultură pentru izolarea şi diferenţierea campilobacteriilor termofile (cu sânge)
- 3.1.1 Motivarea necesităţii elaborării unui mediu de cultură nou
- 3.1.2 Premise teoretice pentru construirea unui mediu de izolare şi diferenţiere a campilobacteriilor termofile
- 3.1.3 Caracteristica ingredientelor folosite pentru pregătirea mediului de cultură
- 3.1.4 Limitele ingredientelor mediului de cultură
- 3.1.5 Tehnologia mediului pentru izolarea şi diferenţierea campilobacteriilor termofile
- 3.1.6 Testarea calităţilor mediului de cultură pentru izolarea şi diferenţierea campilobacteriilor termofile
- 3.2 Mediu de cultură cu acid L-glutamic pentru izolarea şi cultivarea campilobacteriilor termofile (transparent, fără sânge)
- 3.2.1. Argumentarea necesităţii elaborării unui mediu de cultură fără sânge pentru izolarea şi cultivarea campilobacteriilor termofile şi premise teoretice pentru construirea lui
- 3.2.2 Ingrediente folosite pentru pregătirea mediului de cultură experimental cu acid L-gluamic pentru izolarea şi cultivarea campilobacteriilor termofile şi limitele lor
- 3.2.3 Tehnologia mediului de cultură experimental cu acid L-glutamic pentru izolarea şi cultivarea campilobacteriilor termofile
- 3.2.4 Testarea calităţilor mediului de cultură experimental cu acid L-glutamic pentru izolarea şi cultivarea campilobacteriilor termofile
CAPITOLUL 4. Izolarea şi identificarea microorganismelor Campylobacter de la pacienţi cu boala diareica acuta din Republica Moldova
- 4.1 Rezultatele izolării C.jejuni şi C.coli pe mediul de cultură pentru izolarea şi diferenţierea campilobacteriilor termofile (cu sânge) şi mediul de referinţă „Geloză – ciocolat ED”
- 4.2 Rezultatele identificării pe mediile propuse şi prin testele de referinţă
- 4.3. Identificarea infraspecifică a tulpinilor izolate
- 4.4 Rezultatele identificării genotipice prin amplificarea genetică multiplex PCR
- 4.5 Analiza comparativa a datelor obţinute pe mediile propuse şi cele de referinţă
- 4.6 Sensibilitatea tulpinilor endemice de Campylobacter la medicamentele antibacteriene
CAPITOLUL 5. Studii şi recomandări privind durata şi condiţiile de păstrare a tulpinilor de Campylobacter (stocarea în calitate de tulpini de control)
CAPITOLUL 6. Recomandări privind perfectarea diangosticului de laborator al infecţiei cu Campylobacter
Referenţi Oficiali
- Valentin Nikitin
doctor habilitat, profesor universitar - Ştefan Plugaru
doctor, conferenţiar universitar
Teze
Acte Normative
