Comisia de atestare
Comisia de acreditare
Comisiile de experţi
Dispoziţii, instrucţiuni
Acte normative
PREGĂTIREA CADRELOR
Nomenclator
Instituţii
Consilii
Seminare
Teze		 Conducători de doctorat
Deţinători de grad
Doctoranzi
Postdoctoranzi
CNAA logo

 română | русский | english


Aspecte în evaluarea plantelor modificate genetic (Nicotiana tabacum, var. Xanthi) şi metode de identificare a acestora


Autor: Lupaşcu Victor
Gradul:doctor în biologie
Specialitatea: 03.00.15 - Genetică
Anul:2008
Conducător ştiinţific: Maria Duca
doctor habilitat, profesor universitar, Universitatea de Stat din Moldova
Instituţia:
CSS:

Statut

Teza a fost susţinută pe 20 decembrie 2007 în CSS
şi aprobată de CNAA pe 28 februarie 2008

Autoreferat

Adobe PDF document – 0.86 Mb / în română

Teza

CZU 577.218: 575.822: 632.954: 633.71

Adobe PDF document 4.09 Mb / în română
129 pagini

Cuvinte Cheie

expresia şi moştenirea transgenelor, tutun, erbicidul Basta®, testarea PMG

Adnotare

Pentru prima dată au fost cercetate linii experimentale de tutun transgenic care conţin concomitent genele CsLFY şi bar, aflate sub controlul promotorului 35S CaMV în generaţia T1. A fost analizată prezenţa, modul de moştenire şi expresia transgenelor la nivel molecular şi la nivelul caracterelor morfo-fiziologice.

Integrarea transgenelor în genom a fost constatată la analiza ADN-ului prin metoda PCR, utilizând primeri specifici, iar funcţionalitatea transgenelor CsLFY şi bar - la nivel de transcripţie şi la nivel de translaţie. A fost relevată expresia constitutivă a transgenelor, în organele vegetative fiind detectate polipeptidele cu Mr 44 şi 23 kDa - produsele activităţii funcţionale ale genelor CsLFY şi bar.

În generaţia Т1 majoritatea liniilor analizate (10 din 13) au scos în evidenţă moştenirea mendeliană a genei bar după raportul de 3:1 şi deci inserţia transgenei într-un singur cromozom omolog (hemizigote în T0). S-a constatat de asemenea un raport de 15:1, care indică inserarea transgenei în ambii cromozomi omologi (dihemizigote în T0), prcum şi rapoarte atipice de segregare (1:1, 1:3).

Transgeneza şi expresia genei CsLFY la liniile MG determină dimensiuni mai mari ale plantelor, apariţia precoce a florilor, conţinut majorat de proteine, peroxid de hidrogen şi activitatea sporită a catalazei în frunze faţă de control.

A fost relevat rolul funcţional al alogenei bar în generarea mecanismului genetic şi fiziologo-biochimic de rezistenţă faţă de erbicidul Basta în sistem-model. În urma tratării plantelor modificate genetic cu erbicidul Basta a fost observată creşterea conţinutului proteinelor cu Mr 39 kDa, care teoretic corespund enzimei glutaminsintetaza (GS1) şi celor cu Mr 164 kDa, determinată ca enzima glutamatsintaza (Fd-GOGAT), care participă în metabolismul azotului şi contribuie la majorarea rezistenţei faţă de erbicidul Basta.

Analiza liniilor transgenice de tutun a demonstrat diferite nivele de rezistenţă faţă de erbicidul Basta, atât în condiţii de creştere in vitro, cât şi in vivo. Aplicarea erbicidului asupra plantelor reduce conţinutul de apă, proteine, pigmenţi asimilatori, activitatea fotosintezei, induce cloroza/necroza ţesuturilor şi inhibă creşterea plantulelor. De asemenea, au fost observate schimbări calitative şi cantitative în spectrul proteic cu masă moleculară medie şi mică, inclusiv enzima D-ribulozobifosfatcarboxilaza.

Pentru prima dată a fost efectuată testarea PMG prin diferite metode, inclusiv PCR. Analiza PCR nu a atestat prezenţa transgenelor în probele de ADN izolat din fructele de tomate şi cartofi cultivate în Moldova.

Cuprins


CAPITOLUL 1. Concepţii generale privind plantele transgenice şi metodologia de testare a acestora
  • 1.1 Metode de obţinere a plantelor modificate genetic
    • 1.1.1. Etapele de obţinere a PMG. Transgenele
    • 1.1.2. Metode indirecte de transfer al genelor
    • 1.1.3. Metode directe de transfer al genelor
  • 1.2. Detectarea plantelor modificate genetic
    • 1.2.1. Genele marker şi raportoare utilizate în selecţia PMG
    • 1.2.2. Screening-ul PMG prin metoda PCR
  • 1.3. Proteina cu fluorescenţă verde GFP
    • 1.3.1. Structura şi particularităţile de bază
    • 1.3.2. Expresia genei gfp în plantele transgenice
  • 1.4. Enzimele GDH, GS şi GOGAT şi activitatea acestora în PMG
  • 1.5. Aspecte genetice, fiziologice şi biochimice ale plantelor rezistente faţă de erbicidul Basta
    • 1.5.1. Acţiunea fiziologică a erbicidului Basta asupra plantelor
    • 1.5.2. Genele ce oferă toleranţă faţă de erbicidul Basta
    • 1.5.3. Neutralizarea erbicidului Basta în plante
    • 1.5.4. Influenţa diferitor factori asupra rezistenţei faţă de erbicid
Capitolul 2. Obiectul de studiu şi metode de cercetare
  • 2.1. Caracteristica obiectului de studiu
  • 2.2. Condiţii de cultivare
    • 2.2.1. Germinarea in vitro a seminţelor de tutun
    • 2.2.2. Cultivarea plantelor de tutun
  • 2.3. Metode de cercetare
    • 2.3.1. Determinarea indicilor morfo-fiziologici
    • 2.3.2. Determinarea prezenţei peroxidului de hidrogen în frunze
    • 2.3.3. Metode de analiză a ADN-ului
    • 2.3.4. Metode de analiză a ARN-ului
    • 2.3.5. Metoda PCR de identificare a PMG
    • 2.3.6. Analiza cantitativă a proteinelor prin metoda Bradford
    • 2.3.7. Izolarea şi SDS-electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă
    • 2.3.8. Analiza statistică şi evaluarea rezultatelor
    CAPITOLUL 3. Aspecte moleculare şi spaţio-temporale ale expresiei transgenelor
    • 3.1. Atestarea prezenţei transgenelor în genom
    • 3.2. Identificarea şi expresia genelor CsLFY şi bar la nivel de transcripţie
    • 3.3. Identificarea şi analiza expresiei transgenelor la nivel de translaţie
    • 3.4. Moştenirea genei bar în prima generaţie
    CAPITOLUL 4. Particularităţile morfo-fiziologice şi biochimice ale plantelor de tutun transgenic
    • 4.1. Particularităţile morfologice şi ciclului vital al plantelor de tutun transgenic
    • 4.2. Estimarea impactului erbicidului Basta asupra parametrilor morfo-fiziologici şi biochimici
      • 4.2.1. Aprecierea gradului de toleranţă după parametrii morfo-fiziologici
      • 4.2.2. Acţiunea erbicidului asupra conţinutului de apă
    • 4.3. Evaluarea indicilor statutului oxido-reducător
    • 4.4. Acţiunea erbicidului Basta asupra aparatului fotosintetic
    • 4.5. Acţiunea erbicidului Basta asupra proteosintezei
      • 4.5.1. Acţiunea erbicidului asupra proteinelor sumare
      • 4.5.2. Studiul modificărilor calitative ale proteinelor fracţionate la tutunul transgenic sub acţiunea erbicidului Basta
      • 4.5.3. Influenţa erbicidului asupra sintezei proteinelor la nivelul sistemului radicular
    • 4.6. Mecanismul de acţiune a erbicidului Basta asupra tutunului transgenic (ipoteză)
    Capitolul 5. Metode de testare şi evaluare a pmg
    • 5.1. Evaluarea PMG după gradul de „echivalenţă substanţială”
    • 5.2. Metode de identificare a PMG
      • 5.2.1. Detectarea fenotipică a PMG
      • 5.2.2. Detectarea electroforetică a proteinei cu Mr 27 kDa
      • 5.2.3. Testarea PMG prin metoda PCR